Оптимизация микробиологического синтеза

: Опубликовано: 29 мая 2015

12.09.2006

36890

Новая методология оптимизации производства продуктов микробиологического синтеза

Нами разработана принципиально новая методология исследования и совершенствования микробного роста и биосинтеза продуктов, которая позволяет повысить эффективность микробиологических процессов не на проценты, а в несколько раз. Предлагаемые подходы разрабатывались нами на протяжении более 25 лет. Целью этих исследований явилось изучение факторов культивирования, определяющих микробный рост и биосинтез продуктов. В те времена эта задача в основном решалась при выращивании на синтетических средах и, как правило, при непрерывном культивировании. Однако промышленное производство использует, как правило, не синтетические среды, а среды на основе натуральных продуктов или отходов производств, которые представляют сложные смеси, содержащие большинство элементов питания. Выращивание микроорганизмов на производстве осуществляют периодическим, а не непрерывным способом. Учитывая вышеизложенное, был разработан способ оценки питательных потребностей микроорганизмов при их выращивании на средах, приготовленных на основе сложных по составу субстратов. Это позволило приготовить питательные среды, разбалансированные по разным элементам питания. При выращивании микробных культур на этих средах изучено влияние факторов питания на рост и биосинтез. Одними из важнейших факторов роста и биосинтеза являются энергетические затраты на рост и поддержание жизнедеятельности микробных культур. Оценку этих затрат 25 лет назад и в настоящее время производили при непрерывном способе выращивания. Разработанная нами методология исследования энерголимитированного роста позволила измерить затраты на рост и поддержание жизнедеятельности клеток при периодическом культивировании и в дальнейшем привела нас к созданию принципиально новой популяционной теории микробного роста и биосинтеза.

Питательные потребности

Предлагаемая технология оценки питательных потребностей на разных субстратах ориентирована главным образом на органические субстраты, в том числе субстраты, представляющие комплекс самых разных элементов питания (меласса, кукурузный экстракт и др.). Методика позволяет исследовать зависимость питательных потребностей культивируемых микроорганизмов в любом элементе питания и оптимизировать состав субстрата. Способ оценки питательных потребностей микроорганизмов успешно использован при культивации бацилл (B.thuringiensis, B.subtilis, B.sphericus и др.), бактерий-пробиотиков (Bifidobacterium), грибов (Trichoderma, Penicillum) и генноинженерных микроорганизмов (кишечная палочка – продуцент инсулина и псевдомонады – продуценты d-эндотоксина против колорадского жука). Эта методика использовалась для решения самых разных задач:

1. Определение области оптимума, в которой питательные потребности и, следовательно, расход субстрата будут минимальными. Так, для выращивания бацилл и грибов были в короткие сроки разработаны осветленные среды, которые по себестоимости входящих в них компонентов в два раза дешевле сред-болтушек. Показано, что расход ферментативного гидролизата казеина на синтез единицы микробной биомассы или продукта в области оптимальных концентраций, определенных по нашей технологии, может быть снижен в 1,5-3 раза по сравнению с затратами на обычных средах.

2. Формирование питательных сред с недостатком различных элементов питания позволяет исследовать влияние тех или иных субстратов на образование морфологических форм микробов и на синтез целевых продуктов. В результате исследований, выполненных на грибах, получены культуры с концентрацией спор, в несколько раз превышающей их концентрации по данным других авторов. При разработке препаратов против насекомых на основе бацилл, выращивание которых производили на средах, разработанных с учетом увеличения инсектицидных свойств под действием определенного лимитирующего фактора, получены культуры, которые по инсектицидной активности в 20-40 раз превосходили результаты, опубликованные в мировой литературе. Результаты хорошо воспроизводились от опыта к опыту. В настоящее время проводятся исследования по определению лимитирующих факторов, стабилизирующих культуру пеницилл в морфологических фазах синтеза антибиотика.

3. Многокомпонентные субстраты и питательные среды В промышленной биотехнологии в качестве питательных сред часто используют отходы производств пищевой, молочной, лесной и сахаропроизводящей промышленности, которые представляют многокомпонентные субстраты, содержащие большой набор элементов питания, состав которых до конца неизвестен. Например, меласса – побочный продукт производства сахара – содержит в своем составе не только сахарозу, но и другие сахара, различные источники азота (белки, аминокислоты, нуклеиновые основания, мочевину и аммонийный азот), органические кислоты, стеролы, витамины, минеральные элементы. Оценить потребности микроорганизмов при их выращивании на среде, содержащей мелассу, чрезвычайно трудно. По этой причине невозможно стандартизовать эти среды. Также затруднительно определить лимитирующие факторы питания и использовать их для управления процессами роста и биосинтеза продуктов. Нами разработан метод определения по основным элементам питания для грибов ростовых свойств сложных субстратов на базе мелассы. Максимальные ростовые свойства мелассы определяются источниками углерода и энергии. По сравнению с ними имеется небольшой дефицит магния и азота и большой недостаток по фосфору. Степень дефицита каждого лимитирующего фактора можно определить количественно для каждой партии мелассы; для оптимизации условий культивации микроорганизмов следует внести в среду определенное для каждой партии мелассы количество дополнительных компонентов. Это позволяет стандартизовать среды, приготовленные на нестандартном сырье. Данный подход апробирован при оценке и стандартизации различных питательных сред при культивации различных микроорганизмов.

4. Масштабирование процесса культивирования На основе наших исследований проблема масштабного перехода с колб и пробирок на лабораторные ферментеры емкостью до 10 л, а затем в промышленные, объемом от 1 до 100 м3, трансформирована в проблему получения физиологически подобных культур. Такое подобие при выращивании на разных ферментерах достигается действием одинакового лимитирующего фактора, при котором осуществляется биосинтез целевого продукта. Культуры могут различаться по концентрации целевого продукта из-за различий ферментеров по геометрии и некоторым характеристикам, но основной лимитирующий фактор биосинтеза целевого продукта остается неизменным. Высокие инсектицидные свойства средств защиты растений и препаратов против комаров, полученных из культур, выращенных в колбах, были воспроизведены при выращивании в лабораторных и промышленных ферментерах.

Таким образом, предлагаемый способ оценки питательных потребностей микроорганизмов позволяет повысить эффективность роста и биосинтеза продуктов на средах, приготовленных на основе сложных органических субстратов. Он снижает затраты на сырье для сред, повышает синтез продукта за счет правильно подобранного лимитирующего фактора, стандартизует среды по основным ростовым и биосинтетическим свойствам, позволяет воспроизводить результаты при переходе от лабораторных опытов к промышленному производству.

Энергетические затраты и энергопопуляционная модель роста

Энергетические затраты измеряли в условиях энерголимитированного роста, используя уравнения баланса расхода энергии на рост и поддержание жизнедеятельности С.Дж. Перта и других исследователей. Поскольку рост осуществляли в условиях недостатка кислорода, энергетические затраты по скорости роста были приравнены к скорости массопередачи по кислороду для строго аэробных культур. Была отработана методика подпитки сбалансированным концентратом питательной среды и получена культура с концентрацией клеток бактерий свыше 200 млрд в 1мл. Таким образом, была обоснована методология энерголимитированного роста при исключении иных ограничений питания и без ингибирования роста субстратами и продуктами обмена. Для расчета параметров среды выведено достаточно простое уравнение. Использование методологии энерголимитированного роста (которое включает и уравнение) дало великолепные плоды, в том числе и для энергопопуляционной модели. Разработанный подход впервые позволил определять затраты энергии на рост и поддержание жизнедеятельности микроорганизмов в периодических культурах. Практически для всех видов микроорганизмов, которые мы культивировали, были определены затраты на поддержание, которые являются показателем оптимальности среды и условий выращивания. При ограничении роста элементами питания эти энерготраты возрастали. Генноинженерные микроорганизмы, содержащие плазмиды синтеза чужеродного белка, тратили на поддержание жизнедеятельности значительно больше энергии по сравнению с исходными, не содержащими чужеродных плазмид. Но самое большое достижение этой методологии – в открытии параметра ADK (Дербышева-Клыкова), равного отношению энергии поддержания (m) к затратам на собственно рост (a), т.е. ADK=m/a (1), и который является показателем: – распределения энергетических потоков в клетках, – замедления скорости роста, – удельной скорости увеличения концентрации стабильных (неделящихся) форм клеток, отражающим разделение популяции на две категории клеток – делящиеся и стабильные. Значение этого параметра для понимания закономерностей микробного роста так же велико, как удельной скорости роста μ= 1/X×dX/dτ (2) и экономического коэффициента Yx/s = dX/dS (3) – прирост биомассы на единицу затраченного субстрата (питательного вещества). При ограничении роста скорость увеличения общей биомассы снижается, а концентрация стабильных клеток возрастает по экспоненте со скоростью, равной АDK. Экспериментальная проверка при культивировании клеток в ферментерах подтвердила теорию. Клетки из культур разного возраста подвергли стрессовому воздействию в тесте замораживание-оттаивание, в котором жизнеспособность сохранили стабильные клетки, тогда как делящиеся погибли. Было показано, что концентрация устойчивых к стрессовому воздействию клеток в культуре возрастала с удельной скоростью, равной АDK. Структура популяции характеризуется показателем R (доля стабильных форм в общем числе микроорганизмов). Эта величина закономерным образом зависит от удельной скорости роста и концентрации клеток. Физиология делящихся и стабильных клеток имеет большие различия по скоростям потребления субстратов, биосинтеза продуктов метаболизма и их деградации (разрушения) и, как указывалось ранее, по сохранению жизнеспособности при стрессовых воздействиях. Принципиально новым было введение в модель соответствующих коэффициентов потребления субстрата, синтеза продукта и его деградации делящимися и стабильными клетками. Это позволяет количественно определить их значения и использовать полученные данные для оптимизации роста и биосинтеза за счет управления популяционным составом культуры продуцента, его стабилизацией в точке максимальной скорости синтеза продукта и минимальной (нулевой) скорости его разрушения. Таким образом, разработка и использование методологии оценки энергетических показателей роста культур привели к созданию энергопопуляционной теории (ЭПТ) микробного роста и биосинтеза. Метод, разработанный для простых процессов, в полной мере применим и для сложных. В основу легло вышеупомянутое представление о разделении всех популяций на две принципиально значимые части – делящиеся и неделящиеся (стабильные) клетки. Впервые выведены три принципа Клыкова-Дербышева, позволившие развить ЭПТ и являющиеся ее основными положениями: 1) В любой популяции, развивающейся под отрицательным давлением какого-либо фактора, ускорение изменения общего числа особей этой популяции или общего числа закончивших поступательное развитие форм прямо пропорционально скоростям соответствующих изменений, а коэффициент пропорциональности равен абсолютной величине ADK. 2) В любой популяции, развивающейся под отрицательным давлением какого-либо фактора, ускорения изменений для общего числа особей и форм, закончивших поступательное развитие, разнонаправлены, т.е. скорости процессов обратно пропорциональны. 3) Абсолютная скорость потребления или синтеза любого вещества популяцией складывается из слагаемых, вносимых делящимися и неделящимися клетками, причем каждое из слагаемых есть произведение соответствующей удельной скорости потребления (синтеза) на концентрацию соответствующей компоненты популяции. Используя три этих правила, можно получить любые необходимые уравнения и параметры для анализа и планирования любых процессов биосинтеза и биоутилизации. Из них даже можно вывести известное уравнение С.Дж. Перта, которое раньше него приводилось и другими авторами, например, Марром, но всегда априори, как нечто изначально данное: dS=adX+mXdτ (4), где S – энергетический субстрат, X – биомасса микроорганизмов, adX – затраты энергетического субстрата на рост, mXdτ – энергетические затраты на поддержание жизнедеятельности. В нашей трактовке все составляющие уравнение (1) и (4) были выражены в энергетических единицах через теплоту сгорания. В уравнении (1) и (4) коэффициенты «а» и «m» отражают затраты энергетического субстрата на собственно рост и поддержание жизнедеятельности соответственно. Поэтому в формулах (1), (4): а – трофический коэффициент – затрата субстанции питательного вещества на единицу субстанции биомассы, (джоуль/джоуль); m – коэффициент основного обмена (энергия поддержания), количество субстанции энергетического субстрата для поддержания единицы субстанции биомассы в единицу времени (джоуль/джоуль×час). Выявлены также зависимости для конструктивных субстратов и продуктов. Мы считаем, что вышеуказанные принципы имеют общебиологическую значимость, но это выходит за рамки данной статьи, а важнейшим моментом является тот факт, что описываемые количественные математические зависимости для субстратов, продуктов и скоростей их превращений можно перевести в денежные единицы. При проведении собственных экспериментов и анализе опубликованных результатов других авторов показана адекватность модели для широкого круга микроорганизмов (от строгих аэробов до строгих анаэробов) и синтеза различных продуктов (антибиотиков, органических кислот, этилового спирта и др.), а также потребление компонентов субстрата (глюкозы, азота и фосфора). По нашему мнению, универсальность модели для разных продуктов связана с тем, что в фазе замедленного роста любых культур концентрация стабильных клеток увеличивается по экспоненте со скоростью АDK и происходит закономерное изменение возрастной структуры популяции. Использование описываемого подхода позволило при производстве ветеринарных вакцин увеличить на 30-50% выживаемость клеток на технологических стадиях и при хранении препаратов. Расчеты показывают, что если при производстве пенициллина за счет управления процессом предотвратить его разрушение и стабилизировать возрастную структуру популяции в момент максимального синтеза продукта, то его выход можно увеличить в 2-3 раза. Популяционный подход защищен патентом РФ №2228352 «Способ получения биомассы и продуктов ее жизнедеятельности» (авторы и патентовладельцы В.В. Дербышев и С.П. Клыков). В настоящее время имеется положительное решение по зарубежной системе PCT (WO 2005/108591, PCT/RU2004/000172). Метод определения питательных потребностей микроорганизмов является «ноу-хау». Разработанная методология оптимизации биотехнологических процессов на стадии культивирования микроорганизмов является принципиально новой и высокоэффективной. Наша практика показывает, что практически любой процесс роста микроорганизмов и биосинтеза продуктов может быть оптимизирован в короткие сроки (6-12 месяцев) с результатами, в несколько раз превосходящими прототипы (в том числе и мировые). Наши разработки могут быть успешно использованы при решении следующих биотехнологических задач: – оптимизация производства антибиотиков, органических кислот, спиртов, полисахаридов и других продуктов микробного синтеза; – увеличение выхода и выживаемости микробных клеток в вакцинах, пробиотиках (бифидо– и лактобактерии), дрожжах, экологических препаратах и средствах защиты растений; – получение высокоактивных инсектицидных препаратов; – оценка и стандартизация ростовых свойств питательных сред и сложных органических субстратов, в том числе и исходного сырья для их приготовления; – оценка пищевых свойств молока с помощью микробных тест-систем; – повышение качества пива за счет оценки солода по ростовым потребностям для дрожжей и его стандартизации на этапе приготовления.

Некоторые положения и фактические материалы из вышесказанного опубликованы в журналах «Биотехнология» №1, 1996 г. и №2, 2001 г., а также в брошюре Клыков С.П., Дербышев В.В. Связь возрастной структуры биомассы с клеточными синтезами. – М.: Компания Спутник+, 2003. – 48с., ISBN 5-93406-499-1.