НОВАЯ МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ МИКРОБНОГО СИНТЕЗА

В.В. Дербышев, С.П.Клыков, В.В. Кураков

http://cbio.ru/page/43/id/3065/

В результате исследований факторов культивирования, определяющих микробный рост и биосинтез продуктов, была разработана принципиально новая методология расчета и разработки технологии нового поколения микробного роста и биосинтеза продуктов, которая позволяет повысить эффективность микробиологических процессов в большинстве случаев в несколько раз. В настоящем сообщении будут представлены примеры, подтверждающие высокую эффективность нашей методологии. Обмен веществ, характеризующий жизнедеятельность организмов, состоит из процессов ассимиляции и диссимиляции различных веществ. Питание и дыхание – это два основных жизненных процесса у микроорганизмов, имеющие чрезвычайно разнообразные формы проявления. В представленном сообщении именно они являются основными предметами обсуждения. Нами разработано ноу-хау – способ оценки и расчета с последующей оптимизацией и балансировкой питательных сред, в основу которого положен оригинальный метод определения питательных потребностей микроорганизмов в органических субстратах, в том числе, входящих в состав многокомпонентных продуктов питания микробов, таких, как меласса, кукурузный экстракт и подобные им. Использование этой методики позволяет решать самые разнообразные задачи.

1. РОСТОВЫЕ СВОЙСТВА МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ СУБСТРАТОВ НА ПРИМЕРЕ МЕЛАССЫ И ОПТИМИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА ИХ ОСНОВЕ.

Известно, что меласса представляет собой нестандартный побочный продукт сахарной промышленности, который остается после второго отделения кристаллов сахара. В состав мелассы входят практически все элементы питания, которые представлены разными формами. В американском промышленном Руководстве по микробиологии и биотехнологии приведены около 50 качественных показателей мелассы. Основным источником энергии и углерода в этом субстрате является сахароза. По сложности состава меласса превосходит большинство существующих питательных сред для выращивания микроорганизмов. Поэтому решение задачи по определению ростовых свойств разных элементов питания и балансировке сред на основе мелассы означало бы решение общей проблемы стандартизации и оптимизации любых сред.

При культивировании Trichoderma asperellum мы определили ростовые свойства основных элементов питания, содержащихся в мелассе – энергии и углерода, азота, фосфора и магния. В табл.1 представлены их значения, выраженные в процентах по отношению к источнику углерода и энергии.

Таблица 1.

Запас основных элементов мелассы по отношению к источнику энергии и углерода (в процентах) при выращивании Trichoderma asperellum

Показатель Элементы питания в составе мелассы энергия и углерод азот фосфор магний запас питания 100 89,0±1,7 45,9±6,9 102,0±22,4

Анализ ростовых свойств при выращивании Trichoderma asperellum на мелассе показал, что этот субстрат является разбалансированным – в нем не хватает 9-13% азота, 50-60% фосфора, в некоторых партиях недостаток магния может достигать 20%, хотя, как правило, содержание магния в мелассе достаточно. Произведенный расчет ростовых свойств мелассы для выращивания T.asperellum позволил определить влияние разных факторов на формирование морфологических форм – пропагул, разработать оптимальную среду для приготовления препарата против фузариоза пшеницы и овощных и ягодных гнилей.

Последующее выращивание T.asperellum на оптимизированной среде в условиях промышленного ферментера воспроизвело результат, полученный на лабораторных ферментерах (как процесс роста, так и свойств культур). Важное практическое значение методологии анализа ростовых свойств и расчета питательных сред на основе нестандартного сырья типа мелассы – стандартизация сред. Поскольку дефициты определяются количественно для каждой партии мелассы, в среду для их устранения можно вносить определенное для каждой партии мелассы количество дополнительных компонентов среды. Это позволяет стандартизовать среды, приготовленные на нестандартном сырье.

В дальнейшем методология успешно апробирована и реализована в работе с бифидобактериями, выращивание которых производят на казеиновой среде в анаэробных условиях, и позволила оценить ростовые свойства разных партий ферментативного гидролизата казеина (ФГК), анализ которого по нашей методологии показал значительное расхождение качественных показателей разных партий ФГК.

2. МИНИМИЗАЦИЯ ЗАТРАТ СУБСТРАТА.

Неэффективное использование субстрата, особенно органического, является причиной постановки задачи уменьшения расходов на питательные среды. В качестве примера приводим результаты исследования потребления азота ФГК при выращивании Bacillus sphaericus, B.thuringiensis и Bifidobacterium bifidum. Наши исследования показали, что только 4,8% от общего азота ФГК даже в условиях глубокого азотистого лимита переходит в биомассу B.sphaericus, 7,4% – в биомассу Bifidobacterium bifidum и практически весь азот (87,4%) – в биомассу B.thuringiensis. Последнее, по-видимому, связано с высокой протеолитической активностью B.thuringiensis. Как показано на рис.1, затраты субстрата на синтез единицы биомассы (α – показатель конверсии) снижаются при уменьшении его содержания в среде. Показано также, что концентрации других субстратов сильно влияют на эффективность потребления этих субстратов. Так изучение ростовых свойств сред для выращивания B.sphaericus с добавкой до 4г/л дрожжевого экстракта показало, что потребление азота при этом возрастает с 4,8% до почти 24%, и расход ФГК на синтез единицы биомассы можно уменьшить в 4-5 раз. Для выращивания бацилл и грибов были разработаны осветленные среды, которые по себестоимости в два раза дешевле производственных питательных сред в виде суспензий, в которых используют муку и мел. Расход ФГК при этом был снижен в 1,5 –3,0 раза по сравнению с затратами на этих средах.

3.УПРАВЛЯЕМЫЙ БИОСИНТЕЗ.

Еще более важная задача – добиться управляемого биосинтеза как первичных, так и вторичных продуктов метаболизма за счет использования лимитирующих факторов питания, существенно влияющих на синтез целевого продукта. Исследования, выполненные на бациллах, имели целью разработку препаратов против личинок комаров. Была исследована инсектицидная активность культур, выращенных на средах с разными субстрат лимитирующими факторами. Лимитирование оценивали по показателю bal(fk/fn), где fk и fn – разные факторы. Если показатель bal(fk/fn) равен 100%, факторы сбалансированы. Значение этого показателя меньше 100% говорит о лимите фактора fk . Если баланс больше 100%, делается вывод о недостатке фактора fn . Результаты исследований представлены на рис.2

Выводы:

1. В зависимости от лимитирующего фактора активность колеблется более чем в 10 раз.
2. Самая низкая активность при лимите по фактору f3.
3. Самая высокая активность при лимите по фактору f1.
4. При лимите по фактору f2 активность средняя.

Таблица 2

Характеристика культур бацилл, приготовленных на оптимизированных средах в ферментера

Культуры Среда и технология приготовления Концентрация спор, 10^9 спор/мл ЛК50, 10^6сп/мл

Инсектицидная активность, ЛК50/мл, *10^6 B.thuringiensis Заводская, Бердск Заводская, ГНЦ ПМ Опытная, ГНЦ ПМ 4-5 3-4 3,3-4,4 2000 700 25-34 2,0-2,5 4,2-5,7 не менее 97.0 B.sphaericus MBS, ин-т Пастера Опытная №1, ГНЦ ПМ Опытная №2, ГНЦ ПМ Опытная №3, ГНЦ ПМ 3,5-5,3 5,1 4,5 1400-2000 800 112 1,0 2,5-2,6 6,4 40,0

Вывод:

Использование предлагаемой методологии позволило разработать среды, при выращивании на которых B.thuringiensis удалось повысить инсектицидную активность почти в 20 раз, а на среде №3 для B.sphaericus в 40 раз. Исследования морфологических форм T.asperellum, выращенной на разбалансированных средах, позволило увязать тип пропагул с питанием. Образование фиалоконидий стимулировали избыток элементов питания – азота в форме сернокислого аммония и мочевины, фосфатов калия и сахарозы и, напротив, препятствовали недостаток фосфора, азот в нитратной форме, наличие микроэлементов, кальция и цинка. Образование хламидоспор стимулировали фосфаты калия, нитраты, кальций и цинк, но задерживали образование и избыток азота в легкоусвояемой форме (мочевина и сернокислый аммоний).

4.МАСШТАБИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ.

На основе наших исследований проблема масштабного перехода с колб для аэробов и пробирок для анаэробов в лабораторные ферментеры емкостью до 10л, а затем и в промышленные объемом от 1 до 100м3, трансформирована в проблему получения физиологически подобных культур, подобие которых при выращивании на разных ферментерах достигается действием одинакового лимитирующего фактора, при котором осуществляется биосинтез целевого продукта. Культуры могут различаться по концентрации целевого продукта из-за различий ферментеров по геометрическим, реологическим и некоторым другим характеристикам, но основной лимитирующий фактор биосинтеза целевого продукта остается неизменным. Высокие инсектицидные свойства средств защиты растений и препаратов против комаров, полученных из культур, выращенных в колбах, были воспроизведены при выращивании в лабораторных ферментерах. Была воспроизведена на промышленном ферментере технология культивирования T.asperellum, разработанная вначале во встряхиваемых колбах и повторенная в лабораторных ферментерах. По свойствам полученные культуры практически не различались.

5. ЭНЕРГОПОПУЛЯЦИОННАЯ МОДЕЛЬ.

Одним из важнейших факторов роста и биосинтеза целевого продукта являются энергетические затраты на рост и поддержание жизнедеятельности микробных культур. Разработанная методология исследования энерголимитированного роста микроорганизмов-продуцентов позволила измерить затраты энергии на рост и поддержание жизнедеятельности клеток при периодическом культивировании и создать энерголимитированную популяционную теорию микробного роста и биосинтеза.

Основным результатом исследования энерголимитированного роста стало открытие параметра Дербышева-Клыкова (AДК), равного отношению энергии поддержания m к затратам на собственно рост a (m/a), который является показателем распределения энергетических потоков в клетках и замедления скорости роста в уравнении:

X = Xр – (Xр – Xlim) × exp(-AДК) × (t – t lim) /1/ ,

где Х-концентрация биомассы, t – возраст, символы р и lim относятся к «равновесному» значению и концу экспоненциальной фазы роста.

Разделение клеток по возрастной структуре на клетки нулевого возраста (фаза G1 для эукариотов и фаза В для прокариотов) и активно делящиеся позволило установить один из механизмов замедления общей скорости роста – накопление покоящихся клеток с постоянной скоростью AДК. Это подтверждено экспериментально и обосновано теоретически.

Известно, что физиологические свойства клеток, в т.ч. потребление субстратов и выделение продуктов синтеза, существенно изменяются в разных фазах клеточного цикла. Разделение биомассы на 2 фракции – делящуюся (xdiv) и стабильную (хst) позволило использовать cкорость синтеза продуктов жизнедеятельности и потребления субстратов делящимися клетками и скорости разрушения продуктов и выделения субстратов стабильными клетками. для описания процессов синтеза вторичных метаболитов. Поскольку в процессе роста состав популяции изменяется, соответственно колеблется и эффективность биосинтеза продуктов вторичного обмена. Поэтому разработаны методы оценки состава популяции и поддержания его на оптимальном уровне, позволяющем добиться максимальной эффективности биосинтеза.

На рис.3 представлены кривые концентрации пенициллина, рассчитанные по значениям показателей энергопопуляционной модели, полученным в результате наших исследований. Были спрогнозированы разные режимы формы организации синтеза пенициллина во время культивирования: периодический процесс (желтый), отливы при неоптимальной скорости синтеза (красный) и отливы при максимальной скорости синтеза (светло-зеленый). Во всех этих случаях пенициллин не только синтезировался, но и частично разрушался. Четвертый случай – отливы при максимальном синтезе без разрушения продукта (темно-зеленый). Эффективность процесса неодинакова и зависит от его продолжительности. Однако, даже при разрушении частично продукта, организация оптимальных отливов-доливов позволяет в 1,5-2,0 раза увеличить выход пенициллина по сравнению с неоптимальными отливами и периодическим процессом. Ранее мы показали возможность значительного повышения синтеза микробных продуктов при недостатке некоторых факторов питания. Предварительные исследования по пенициллину позволяют предполагать возможность снижения скорости деградации пенициллина при лимите по некоторым факторам. Поэтому мы считаем возможным синтез без разрушения пенициллина, что позволит дополнительно увеличить выход продукта на 30-40%.

Таким образом, использование энерогопопуляционной модели для управления биосинтезом продуктов позволяет значительно увеличить их выход. Проведенные собственные эксперименты и анализ опубликованных результатов других авторов показали адекватность созданной модели для широкого круга микроорганизмов (от строгих аэробов до строгих анаэробов), синтеза и трансформации различных продуктов (антибиотиков, стероидных соединений, органических кислот, этилового спирта, поли-b-оксимасляной кислоты, левана и др.), а также для потребления питательных веществ (глюкозы, азота и фосфора). Популяционный подход защищен патентом РФ № 2228352 «Способ получения биомассы и продуктов ее жизнедеятельности» (авторы и патентовладельцы В.В. Дербышев и С.П. Клыков).

В настоящее время имеется положительное решение по зарубежной системе PCT, и процесс патентования вступает в национальные фазы. Наши исследования показывают реальность разработки любой технологии биосинтеза продуктов в короткие сроки с результатами, превосходящими прототипы (в том числе и мировые) в несколько раз. Конкурентные преимущества технологии. Универсальность применения технологии практически к любым микробиологическим объектам (процессам) и значительное повышение эффективности производства микробиологических продуктов в короткие сроки (6-12мес в зависимости от масштаба текущего производства).

Область применения. Наши разработки универсальны и могут быть использованы в следующих сферах:

• – производство антибиотиков, стероидов, органических кислот, спиртов, полисахаридов и других продуктов микробного синтеза и трансформации;
• – увеличение выхода и выживаемости микробных клеток в вакцинах, пробиотиках (бифидо– и лактобактерии), дрожжах, экологических препаратах и средствах защиты растений;
• – получение высоко активных инсектицидных препаратов; оценка ростовых свойств питательных сред и сложноорганических субстратов, в том числе и исходного сырья, для их приготовления и стандартизации.

Ключевые научно-исследовательские и инженерные проблемы.

Для реализации и внедрения технологии в производство отсутствуют научно-исследовательские и инженерные проблемы. Имеющееся на рынке технологическое оборудование, средства контроля и управления и разработанная принципиально новая методология по разработке технологий нового поколения позволяют уже сейчас внедрять разработку в производство. Привлекательность потенциала организации/научно-исследовательской организации для инвесторов. Авторы предлагаемого проекта имеют богатый и обширный опыт работы на различных объектах, начиная от лабораторных исследований, разработке регламентов, внедрение технологий производства вирусов, бактерий, грибов, дрожжей, и заканчивая авторским контролем и сопровождением после внедрения в производство. Все авторы предлагаемого проекта являются кандидатами наук (медицинских, биологических, технических), работали в ведущих научно-исследовательских учреждениях СССР и РФ, имеют практический опыт работы в международных проектах. Один из авторов – лауреат Государственной премией СССР. Кроме того, имеется богатый опыт организации и управления фармацевтическими производствами.

Основная область компетенции организации.

Разработка практически всех без ограничений технологий нового поколения в области микробиологических процессов. Привлекательность технологии/продукта для инвесторов. Привлекательность проекта заключается в его:

• – универсальности применения к любым микробиологическим процессам, в которых микроорганизмы используются как для накопления биомассы, как таковой, так и в процессах, где микроорганизмы являются продуцентами различных метаболитов;
• – возможности перевода микробиологического процесса на технологию нового поколения в сжатые сроки;
• – возможности использование имеющегося технологического оборудования; высокой эффективности отдачи от внедрения технологии нового поколения.

Возможные формы сотрудничества.

Лицензионный договор, договор о совместной деятельности по разработке на основании технического задания Заказчика оригинальной технологии для любого микробиологического процесса, авторский надзор и сопровождение по окончании внедрения технологии в производство. Необходимый размер инвестиций. Размер инвестиций зависит от формы сотрудничества и масштаба предполагаемой к реновации технологии.